目的：红花注射液是由中药红花经提取而成的黄色至棕红色的灭菌水溶液，具有活血化瘀、消肿止痛之功效，临床上主要用于闭塞性脑血管病、冠心病、脉管炎等疾病的治疗。近年来，时有关于其不良反应的报道。红花注射液所引起的不良反应以变态反应为首，主要表现为皮疹、发热和过敏性休克等速发型超敏反应。本研究的主要目的是通过分离红花注射液引起超敏反应的成分，分析其理化性质，进一步了解红花注射液导致超敏反应的组分及相关的免疫学机制，以期为今后的生产和临床应用提供参考意见。

方法： 1、用化学萃取、蒸馏等方法将红花注射液分离成若干组分，并运用HPLC方法分析分离提纯的有效性； 2、将这些分离提纯的组分通过对豚鼠腹腔注射致敏、心内注射激发的方法建立速发型超敏反应的动物模型； 3、利用间接ELISA法检测人及豚鼠血清中能够识别红花注射液中变应原的特异性抗体，并利用双抗体夹心ELISA法检测致敏豚鼠血清中总IgE的水平； 4、利用³H-TdR掺入法检测红花注射液中的变应原对小鼠脾细胞的促增殖作用； 5、利用RT-PCR法检测红花注射液中的变应原对小鼠腹腔巨噬细胞的作用。

结果： 1、红花注射液能够引起豚鼠的I型超敏反应，在分离、提纯的各组分中以乙醚提取物的致敏作用最强，且具有统计学意义(P<0.05)； 2、在一份人血清中能够检测到识别红花注射液成分的特异性IgG抗体； 3、用红花注射液免疫小鼠后，部分小鼠的脾细胞在体外被LPS和Con A刺激的增殖指数与生理盐水免疫小鼠相比有明显的增高。

结论： 1、红花注射液中确实存在能够引起过敏反应的变应原，且可能是脂溶性相对较大的成分； 2、用红花注射液免疫小鼠后，部分小鼠的脾细胞在体外更易于被LPS和Con A这样的非特异性刺激剂活化，故认为红花注射液中的变应原可能通过降低脾细胞被活化的阈值而引发超敏反应，但有待进一步证实；3、豚鼠速发型超敏反应动物模型建立的方法可作为检测药物过敏的手段之一。

Objective:  Safflower is used on the treatment of obliterated cerebral vascular disease, coronary artery disease and angeitides, etc. However, side effects of safflower has hampered its application in clinic. Of these side effects, anaphylaxis is the most common and could be lethal. The main purpose of this investigation is to separate and characterize those allergens, to further explore the immunological mechanisms of safflower-induced anaphylaxis, and hope to provide therapeutic suggestion for the manufacture and clinical application of safflow in future.

Methods:  1. Separation of safflower injection into several extracts by chemical extraction and analysis of these extracts by HPLC.  2. To establish the animal model of immediate hypersensitivity by sensitizing guinea pigs with peritoneal injection of safflower and followed by intracardiac injection.  3. To detect safflower-specific antibodies in human and guinea pig sera by indirect ELISA, and total IgE level in guinea pig sera by double antibody sandwich ELISA.  4. ³H-TdR incorporation was performed to analyze activation of mice splenocytes by allergens in safflower.  5. Analysis of activation of mice peritoneal macrophages caused by allergens in safflower using RT-PCR.

Results:  1. Safflower injection can induce immediate hypersensivitity in guinea pigs; of all extracts, sensitization of ether extracts caused the most significant reaction.  2. Safflower-specific IgG was found in one human serum.   3. The function of safflower on mice splenocyte is still to be determined further.

中文摘要………………………………………………………………4

英文摘要………………………………………………………………6

引言……………………………………………………………………8

第一章 材料和方法………………………………………………..9

  1.1 实验材料……………………………………………………………………..10

1.1.1  注射用液………………………………………………………………..10

1.1.2  抗体和工具酶…………………………………………………………..10

1.1.3  试剂盒…………………………………………………………………..10

1.1.4  主要试剂………………………………………………………………..10

1.1.5  引物……………………………………………………………………..11

1.1.6  血清样品………………………………………………………………..11

1.1.7  实验动物………………………………………………………………..11

1.1.8  常用溶液的配制………………………………………………………..12

1.1.9  实验设备………………………………………………………………..13

1.1.10  实验耗材………………………………………………………………13

  1.2  实验方法…………………………………………………………………….14

1.2.1  红花注射液的分离、提纯……………………………………………..14

1.2.2  红花注射液及其分离组分的HPLC成分分析………………………..14

1.2.3  豚鼠速发型超敏反应动物模型的建立………………………………..14

1.2.4  红花注射液成分与BSA的偶联……………………………………….16

1.2.5  酶联免疫吸附实验……………………………………………………..16

1.2.6  红花注射液所含变应原对小鼠脾细胞活化作用的检测……………..17

1.2.7  红花注射液变应原对小鼠腹腔巨噬细胞活化作用的检测…………..17

1.2.8  统计学分析及计算机应用软件………………………………………..18

第二章  结果………………………………………………………..20

  2.1  红花注射液及其分离组分引起的超敏反应……………………………….21

2.1.1  红花注射液的分离与分析……………………………………………..21

2.1.2  红花注射液及其组分引起的超敏反应………………………………..22

2.1.3  各组豚鼠血清中总IgE水平的检测…………………………………..25

  2.2  红花次级分离组分所致豚鼠超敏反应…………………………………….25

  2.3  能识别红花注射液及其成分的特异性抗体的检测……………………….28

2.3.1  红花注射液中成分与BSA的偶联……………………………………28

2.3.2  能识别红花注射液成分的特异性人IgG抗体的检测………………..29

2.3.3  能识别红花注射液成分的特异性人IgE抗体的检测………………...29

2.3.4  能识别红花注射液成分的特异性豚鼠IgG抗体的检测……………..31

  2.4  红花注射液中的变应原对小鼠脾细胞的活化作用……………………….32

2.4.1  红花注射液免疫小鼠的脾细胞在体外对Con A的反应性………….32

2.4.2  红花注射液免疫小鼠的脾细胞在体外对LPS的反应性…………….34

  2.5  红花注射液中的变应原对小鼠腹腔巨噬细胞的活化作用……………….36

第三章  讨论………………………………………………………..37

  3.1  速发型超敏反应动物模型的建立………………………………………….38

3.1.1  豚鼠速发型超敏反应动物模型的建立………………………………..38

3.1.2  超敏反应动物模型的客观检测指标…………………………………..39

  3.2  红花注射液初次分离组分的HPLC分析………………………………….40

  3.3  红花注射液中的成分、与BSA的偶联及特异性抗体的检测……………40

3.3.1  红花注射液的成分及可能的变应原…………………………………..40

3.3.2  红花注射液成分与BSA的偶联……………………………………….41

3.3.3  人及豚鼠血清中红花特异性抗体的检测……………………………..41

  3.4  红花注射液引起超敏反应的机理探究…………………………………….42

  3.5  对临床及工业的意义……………………………………………………….42

结论…………………………………………………………………..44

文献综述………………………………………………………………..45

1.       前言…………………………………………………………………………...46

2.       药物过敏反应……………………………………………………………..47

2.1  药物过敏反应概述……………………………………………………...47

2.2  药物过敏反应的发生机制……………………………………………..48

   2.2.1  药物过敏反应的分类……………………………………………….48

   2.2.2  药物被免疫系统的识别…………………………………………… 48

2.3  速发型超敏反应…………………………………………………………51

   2.3.1  速发型超敏反应概述……………………………………………….51

   2.3.2  IgE与速发型超敏反应……………………………………………..52

   2.3.3  速发型超敏反应的效应细胞………………………………………54

2.3.4  速发型超敏反应与临床疾病………………………………………55

    2.3.5  速发型超敏反应动物模型的建立…………………………………56

3.  中药注射剂的不良反应……………………………………………….......58

  3.1  中药注射剂不良反应的表现……………………………………….......59

  3.2  中药注射剂不良反应的原因分析………………………………….......59

  3.3  红花注射液的不良反因及原因初探…………………………………...60

参考文献…………………………………………………………….62

英文缩略语………………………………………………………….71

致谢………………………………………………………………….73

个人简历…………………………………………………………….74